TEKNIK-TEKNIK ASAS BIOLOGI
Teknik-Teknik Asas Bakteria
Sebelum anda memulakan kerja amali berhubung dengan semaian bakteria, anda perlu ingat tentang perkara-perkara berikut:-
1. Pelupusan Sisa-sisa Semaian:
Walaupun bakteria patogenik ( Patogen ) Sekali-kali tidak boleh digunakan didalam kerja-kerja amali. Patogen ini boleh hidup dan menbiak jika keadaan sekeliling sesuai bagi pembiakan bakteria seperti ini .Bakteria sentiasa terdapat di udara dan bakteria patogenik boleh dibawa oleh penutut-penutut yang sakit jika terdapat tempat semaian yang sesuai bakteria boleh menbiak dengan pesatnya pada tahap yang sangat yang merbahaya. Kedua, Bakteria takpatogenik boleh mutet ( mutate ) untuk menjadi patogen. Masalah disin adalah untuk mengetahui mana-mana bakteria yang boleh menjadi mutan patogenik. Sebab inilah maka semua bakteria mesti dianggap sebagai potensi patoogen.
Semaian hendalah dihapuskan dengan cara:
a) Semaian air daging yang direbus, kaldu, bubur,
i. Jika semaian tak spora ia boleh dihapuskan dengan cara membuka penutup dan merendangkan tub (bekas) dalam larutan 10% lysol. Satu bekas khas mestilah disediakan didalam makmal untuk tujuan ini dan dilebel dengan terang.
Piring petri hendaklah juga direndam dalam 10% larutan lysol.
ii. Jika semaian spora, semaian ini hendaklah dipanaskan hingga 121 darjah celcius 15 minit di dalam oven ( 15 Ib - in 2 tekanan ). Jika organisma spora hendaklah digunakan satu bekas lain yang berlebel hendaklah digunakan, dan mesti ditutup. Bekas ini akan dipanaskan dalam oven. Kedua-dua semaian ini hendaklah dicampakkan ke dalam sinka dan di lupuskan dengan air yang banyak atau dengan cara yang lebih baik, iaitu dilupuskan di dalam jamban.
b) Semaian agar-agar pepejal hendaklah dibungkus dalam kertas dan dibakar . Piring atau bekas hendaklah direndamkan 10% lysol.
Penting :
Jika ubi kentang berbentuk sedang hendaklah digunakan, mungkin murid-murid akan membuat ujikaji di rumah. Oleh itu ubat pembasmi kuman yang kuat ( disifectant ) hendaklah digunakan sebelum semaian dilupuskan.
1.1. Penggunaan pakaian luaran adalah digalakkan.
1.2. Jika semaian bakteria terjatuh di atas meja, kerusi atau lantai, anda hendaklah:
Mencucinya dengan 3% lysol, dengan serta merta. Keadaan seperti ini hendaklah
dianggap bahaya.
1.3. Begitu juga jika semaian bakteria terkena tangan anda hendaklah membasuh tangan dengan larutan lemah centrimide, lysol.
1.4. Kedua belah tangan hendaklah dibasuh sebelum dan selepas kerja-kerja amali.
1.5. Makanan TIDAK boleh dimakan didalam makmal.
1.6. Apabila permuka cecair pecah beberapa titik cecair akan terjadi. Kebanyakannya akan terjatuh ke lantai, tetapi yang paling kecil akan terapung-apung di udara. Jika cecair berwap, bakteria akan terapung-apung di udara. Jika kumin ini disedup ianya akan segera masuk ke dalam paru-paru membiak dan membinasakanya.
Selalunya cuai menyedut cecair dengan pipet menyebabkan pencemaran udara. Apabila semaian tumbuh di atas semaian bahan tara pepejal dalam botol bertutup, skru membuka penutup ini akan melepaskan kumin-kumin ke udara. Selalunya, satu lapisan bendalir ini akan pecah dan melepaskan titik bendalir terapung-apung di udara.
1.7. Jangan sekali-kali menjilat label dan menggunakan mulut untuk menyedut pipet.
1.8. Bangku dan meja hendaklah di basuh dengan bahan pembasmi kuman sebelum dan sesudah kerja amali.
1.9. Merokok tidak di benarkan di dalam makmal.
2. Bahan tara semaian:
Jarang sekali identiti organisma mikro dapat dikenali melalui sifat-sifat sruktur sahaja. Mereka misti dipelihara dengan menggunakan bahantara tiruan dan satu organisma mesti di biakan berasingan.
2.1. Jenis-jenis bahantara:
a) Cecair atau Pepejal
Kegunaan bahantara cecair tidak menampakkan bahan semaian dengan nyata. Dengan itu penggunaan bahantara cecair tidak digalakkan kecuali untuk ujian biokimia tertentu.
Bahantara pepejal biasa digunakan sebab ia menampakan kebiasaan sifat pertumbuhan bagi satu-satu bakteria.
b) Air
Air paip tidak sesuai untuk kerja ini.Selalu gunakan air suling atau air tak- ionik. Air tak-ionik lebih sesuai dan menjimatkan masa. Ianya mempunyai kelebihan senang di angkup dan tidak memerlukan haba atau tenaga elekrik walau bagaimanpun mungkin terdapat larutan sebatian organik yang terjadi daripada resimdan akan memberi kesan terhadap protozoa.Air mestilah mengandungi 1.5 p.p.m. ( bahagian dalam sejuta bahagian ) garam. Dengan demikian air suling berlogam tidak sesuai digunakan.
c) Agar-agar
Agar-agar sebenarnya adalah sejenis polysacharide. Dalam larutan bercair ia mengeluarkan satu gel yang tidak cair di suhu yang tinggi. Hanya sebilangan kecil bakteria samudera yang akan menyebabkan ia rosak dan berair.Ia juga tidak menambah sifat-sifat noritif satu-satu bahantara dan juga bebas dari bahan-bahan pertumbuhan.
Takat lebur dan pemejalan adalah berbeza. Kebanyakan agar-agar lebur pada 95 darjah celsius dan memejal pada 45 celsuis. Ini bermakna Nutrium yang sensitif pada haba boleh di tambah pada suhu yang agak rendah.
Setelah steril ( dibersih dari kuman ) agar-agar boleh dibiarkan memejal dan disimpan untuk keggunaan masa hadapan, tetapi ianya mesti di lebur dengan sedikit haba dan digunakan terus.
Jika agar-agar disediakan dalam masa yang pendek, adalh lebih baik ianya disimpan dalam bentuk cecair dalm air panas 45- 50 darjah celsius. Ini adalah untuk mengelak pembuagan masa dalm memanaskannya pada suhu yang tinggi.
2.2 Memilih bahantara
Ini bergantung kepada jenis organisma dan sifat cara penyelidikan.
Jika satu bahantara dipilih dengan PH diluar banjaran kulat ( fungsi ), bakteria akan hidup tetapi pertumbuhan kulat akan terhap.Bakteria biasanya di biakkan di tas agar-agar nutrium manakala kulat di biakkan di atas agar-agar ubikentang dekstrosa. Untuk keja-kerja amali agar-agar lain digunakan.
2.3. Bekas untuk bahantara
Jika banyak bahantara hendak di buat, satu kelalang bertutup kapas bulu hendaklah digunakan. Ini juga mesti digunakan jika hedak digunakan.Gunakan botol tabung uji dengan penutup getah gabus atau logam jenis lekat kertas ( slip-on ) dan bertutup jenis skru juga boleh digunakkan.
Penutup logam lekat di atas, mempunyai kelebihan yang ia boleh digunakkan berulang kali tetapi tidak berguna jika semaian hendak disimpan. Kapas bulu boleh digunakkan untuk semaian yang hendak disimpan, tetapi mesti dibuang selepas di gunakkan. Juga, jika suhu dan tekanan bertukar udara masih boleh masuk ke dalamnya. Udara akan ditapis apabila ia melalui kapas bulu, tetapi perlindungan ini tidak terdapat pada penutup logam jenis lekat ke atas.
3. Penstrilan ( basmi kuman )
Untuk membiakan sesuatu mikro organisma, mikro organisma yang lain hendaklah di pupuskan dengan cara penstrilan.
Ada dua cara penstrilan:
3.1 Haba
i. Haba kering
Haba kering mungkin membunuh dengan cara pengoksidaan yang
membinasakan beberapa juzuk sel tertentu.
ii. Haba lembat
Haba lembat lebih berkesan kerana kelembapan membunuh dengan
cara pengumpulan dan mengnyahaslikan ( denaturing ) protein dan enzin, satu proses yang memerlukan air.
Masa yang diperlukan lebih kurang 15 minit, pada 121 darjah celsius. Masa yang lebih lama hendaklah diberi jika terdapat banyak bakteria.
Jenis bahan di dalam mana mikro organisma dipanaskan akan memberikan kesan kepada kecepatan pembinasaan. Bahan kinia organik biasanya melindungi organisma. Lemak yang lembab menghalang kemasukan air dalam organisma. Penentangan haba oleh spora adalah maksima pada nilai ph nuetral.
3.2. Bahan kimia
Hanya beberapa bahan sahaja yang mempunyai kesan ke atas spora. Perkataan disinfectant dan antiseptik digunakan kepada bahan kimia yang berlainan, walaupun kedudukannya memberi maksud pembasmi kuman. Bahan disinfectant merupakan bahan kimia yang toksik (Bisa ataua racun) . Bahan antiseptik tidak toksik dan boleh dikenakan pada bahagian luar tisu hidup.
Jenis Bahan Kimia.
A. Antiseptik dari kumpulan phenol - seperti lysol (biasanya 3% dalam larutan air)
Ia bertindak dengan cara pengumpulan protein.
B. Halogen - hipokrip biasa digunakan. Helogen tidak dapat bertindak adalam bahan organik yang berkesan ke atas spora. Selalunya helogen digunakan dengan bahan pembasuh. (Cecair). Kerana organik terutamanya kesan lemak .
c. Etilalkohol - selalunya berkesan diantara 50 % - 70 % tetapi tidak berkesan dalam kekuatan selebihnya. Bahan ini digunakan terutamanya untuk menyejuk siku platinun, setelah dipanaskan dalam anyalaan api apabila tidaak digunakan. Alat penstrilan boleh disimpan dalam alkohol.
D. Formeldehyde
Bahan ini sangat berguna kerana ia boleh dikenakan ke atas bahan yang akan rosak akibat dipanaskan. Selalunya digunakan dalam larutan 0.1 hingga 0.5 % .
e. Sabun dan bahan basuh. - Tindakan adalah disebabkan oleh kepekatan pada permukaan antara air dan objek, membawa kepada menurunnya tekanan permukaan dan sebab itu sel-sel akan binasa.
F. Certimide dan keloros - kedua-duanya boleh didapati dari kedai kimia tempatan, tapi tidak berkesan terhadap spora.
3.3. Teknik-Teknik Penstrilan Yang Selalu Digunakan Di Sekolah-Sekolah.
A. Siku inokulasi (inoculating loop) dan titik-titik forcep .
panaskan dalam nyalaan bunsen sehingga panas merah.
B. Mulut-mulut tub semaian, penutup kapas bulu, slide klip penutup skalpal dan jarum.
Stril dengan melakukannya dalam api bunsen tanpa bahan itu menjadi panas merah.
C. Piring petri, tabung uji, kelalang, pipet dan semua peralatan.
Sebelum penstrilan dijalankan , kelalang dan tabung uji hendaklah ditutup dengan kapas bulu. Pipet hendaklah disalut oleh kertas coklat (Brown paper) sila ambil perhatian iaitu setengah-setengah kapas bulu mengeluarkan bahan coltaile semasa dipanaskan dan akan melekat terus kepada akaca apabila disejukkan. Oleh yang demikian gantikan dengan penutup logam, letak di atas (Slip on metal caps) jalankan penstrilan pada 160 cesius untuk selama sejam.
Semua botol bertutup jenis skeru mestilah distril dalam kukus tekanan.
D. Lemak , Minyak dan Gris - stril dalam oven berudara panas.
Oven jenis ini membenarkan haba panas masuk perlahan, bahan-bahan ini hendaklah distril dalam lapisan nipis tidak lebih dari 0.5 cm tebal dalama piring petri.
Apabila amenggunakan oven udara panas, janganlah masukkan piring petri sehingga sesak kerana udara hendaaklah dibiarkan bergerak bebas.
Setelah selesai , pintu oven tidak boleh dibuka dengan segera. Biarkan sekurang-kurangnya 2 jam kerana barang kaca akan retak jika ia dibenarkan sejuk terlalu cepat.
E. Bahantara semaian, kapas bulu bahan berliang . penutup mengandungi lapisan getah stril dalam kukus tekanan.
4. Menuangkan ke dalam piring.
4.1. Agar-agar mestilah cair tapi tidaklah panas daripada yang boleh ditanggung oleh pipi anda sendiri. Jika ia dituang terlalu panas (steaming) kondensasi akan terjadi pada penutup. Kodensasi akan boleh terjadi suhu 45 celsius. Jika boleh, panaskan sedikit piring itu. Kerja-kerja ini hendaklah dijalankan jauh dari udara lembab.
4.2. keluarkan penutup dari botol. JANGAN sekali-sekali letakkan penutup di atas bangku, ini akan menyebabkan pencemaran. Begitu juga botol tidaka boleh ditegakkan , ianya mesti disendengkan.
4.3 Panaskan leher botol dalam nyalaan bunsen. Dengan tangan lain angkat piring petri. Jangan buangkan penutup piring petri, cuma ketepikan sedikit sahaja supaya bahantara dapat dituangkan ke dalam.
5. Suntikan Bahantara semaian.
Selalunya siku platinam atau nikron digunakan dengan memanaskan di dalam api bunsen.
5.1 menyuntik kaldu, bubur, air daging yang direbus atau sendeng ubi kentang.
a.jika botol bertutup jenis skru digunakan, longgarkan penutup sehingga terletak di atas.
B. Pegang botol tabung mengandungi semaian dan pegang betol yang lain dengan tangan kiri.
C. Panaskan siku platinum dengan tangan kanan.
D. Kemudian masukkan siku platinum dalam 50% larutan alkohol.
E. Ketepikan penutup botol yang hendak dijalankan suntikan dengan jari tengah tangan kanan.
F. Nyalakan lehir botol. Menyalakan leher botol tak semestinya membunuh kuman bakteria, tetapi ia menahan bakteria dari masuk ke dalam botol,
g. Masukkan siku platinum ke dalam botol dan carikkan permukaan semaian.
H. Keluarkan siku platinum dan keluarkan penutup botol yang lagi satu dengan jari empat tangan kanan.
I. Masukkan siku platinum yang mengandungi semaian dan lerikkan ke atas sendeng atau masukkan ke dalam bubur larutan daging rebus, kaldu, keluarkan suhu platinum dan nyalakan sekali lagi.
J. Nyalakan leher kedua-dua botol ataua tabung dan panaskan penutup.
6. Pengeraman. (Incubation)
Kebanyakan bakteria memerlukan suhu 37 celsius untuk pembesaran optima.
pengeraman semaian piring petri, hendaklah dengan cara membalikkan piring petri supaya kodensasi air berlaku.
