PENYEDIAAN SISIP MIKROSKOP
Teknik Menyediakan Sisip Mikroskop
Teknik menyediakan mikroskop iaitu suatu bidang yang luas. Tujuan bahan ini bukanlah untuk menghuraikan secara meluas dan mendalam tentang bidang ini,tetapi hanya memperkenalkan prisip-prisip asas serta beberapa teknik biasa yang boleh digunakan oleh guru-guru sains di sekolah.
Penyediaan sisip kaca mikroskop biasanya melibatkan langkah-langkah yang berikut :
i) Penetapan/pengikatan
ii) Membuat keratan
iii) Perwarnaan
iv) Pendehidratan
v) Mencuci
vi) Lekapan
Kesemua enam langkah tersebut diperlukan untuk penyediaan sisisp kekal, tetapi bagi peyediaan sisip sementara langkah (i), (iv), dan (v) boleh di tinggalkan. Sisip-sisip kekal, jika disediakan dengan baik boleh disimpan selama beberapa tahun. Sebaliknya sisip sementara hanya boleh digunakan sekejap sahaja, kadang kala kurang daripada setenjah jam.Walaubaimanapun sisip sementara lebih kerang disediakan oleh guru-guru biologidi sekolah kerana lebih menjimatkan banyak masa dan kerja, berbanding dengan sisip kekal.
(i) Penetapan/pengikatan
Bahan-bahan biologi yang hendak digunakan untuk menyediakan sisip mesti direndam dalam sejenis cecair atau larutan untuk menyelakkan tindakan bakteria atau kulat. Cecair atau larutan itu dinamakan agen penetap/pengikat manakala proses ini dipanggil penetapan/pengikatan.
Agen pengikat/penetap yang biasa sekali digunakan untuk tisu-tisu tumbuhan ialah ‘ Formalasetik-alkohol’ (FAA). FAA dsediakan dengan mencampurkan lebih kurang 5 cm3 asid asetik glasial 90 cm3 etanol 70% dan 5 cm3 formaldehid 40%.
Tisu-tisu haiwan boleh direndam dalam fomalin neutral. Formalin neutral disediakan dengan mencampurkan sedikit larutan dinatrium tetraborat (boraks) kepada fofmaldehid 40% sehingga menjadi neutral kepada kertas litmus.
Untuk maklumat lanjut tentang jenis-jenis agen penetap/pengikat sila rujuk kepada buku-buku lain.
(ii) Membuat keratan tisu
Tisu-tisu biologi yang hendak diperiksa dengan mikroskop mesti wujud dalm bentuk keratan nipis yang boleh ditembusi cahaya. Keratan tisu tumbuh-tumbuhan lebih mudah disediakan kerana ia lebih keras daripada tisu haiwan.Untuk membuat keratan, tisu tumbuhan biasanya diapit dengan kepingan polistirene sebelum dipotong .
Tisu haiwan yang hendak dikerat mestilah terlebih dahulu direndamkan dalam parafin untuk menjadikannya keras.Langkah-langkahnya adalah seperti berikut:
1. Panaskan sedikit pepejal parafin ( suhu lebur lebih kurang 52-56 celsius ) pada suhu 2 atau 3 darjah lebih tinggi daripada suhu leburnya,dengan kukus air.Masukkan tisu haiwan yang tersebut ke dalam cecair parafin dan biarkan selama satu jam pada suhu yang sama.
2. Ambil sebuah kotak mancis dan sapukan bahagian dalamnya dengan sedikit gliserol.Tuangkan parafin panas (suhu tidak melebihi 58 darjah celcius ) ke dalam kotak mancis tersebut. Letakkan tisu haiwan di bahagian tengah cecair parafin.
3. Pegang kotak mancis itu di atas sebaldi air sejuk dan tiupkan permukaan parafin lebur itu dengan angin,Apabila cecair parafin di permukaan membeku, rendamkan seluruh kotak mancis tersebut ke dalam baldi berisi air sejuk itu. Kesemua parafin dalam kotak mancis akan membeku. Sekarang tisu haiwan itu sedia untuk dipotong menjadi kepingan nipis.
Kadangkala tisu-tisu biologi lebih mudah dipotong dengan menggunakan sejenis mikroton tangan. Harga mikrotom tangan ini adalah agak murah dan mampu dibeli oleh semua sekolah. Tisu yang hendak dipotong itu dimasukkan ke bahagian tentah mikrotom. Pusingkan skru di bahagian bawah mikrotom itu satu pusingan kemudian hiriskan tisu yang menonjol ke atas dengan mata pisau cukur.
(iii) Pewarnaan
Pewarna untuk sisip mikroskop boleh dibahagikan kepada dua golongan utama; i) pewarna bersifat bes, misalnya metilena biru fuksin bes, hablur ungu, safranin dan sebagainya ii) Pewarna bersifat asid , misalnya fast green, hijau muda, anilina biru dan sebagainya.
Pemilihan pewarna untuk tisu dibuat berdasarkan sifatnya, iaitu bersifat bes dan asid. Pewarna bersifat bes digunakan untuk mewarnakan bahagian-bahagian tisu bersifat asid, manakala pewarna bersifat asid pula digunakan untuk mewarnakan bahagian-bahagian tisu bersifat bes. Misalnya. Oleh kerana nukleus sel mempunyai asid nukleik, ia bersifat
asid maka nukleus biasanya diwarnakan dengan pewarna-pewarna bes seperti metilena biru atau safranin.
Selain daripada itu, terdapat juga pewarna-pewarna tertentu yang hanya boleh dilekatkan kepada tisu jika sesuatu mordan digunakan bersama. Sebagai contoh, Ferum (III) Ammonium Sulfat ialah sejenis mordan bagi pewarna hematoksilin dalam pewarna tisu haiwan.
(iv) Banyak jenis cecair organik digunakan dalam proses penyediaan sisip mikroskop. Bahan-bahan organik ini, jika dicampurkan dengan air, akan menghasilkan seuatu koloid yang menganggu penglihatan. Oleh itu, sebelum atau selepas proses pewarnaan (Mengikut keadaan) tisu itu biasanya direndam dalam etanol untuk membuangkan kandungan aairnya. Proses pembuangan air ini dinamakan pendehidratan.
Akan tetapi , jika keratan tisu direndam terus ke dalam etanol tulen, terlalu banyak aair diserap keluar, maka sel-sel itu akan berubah bentuknya atau menjadi rosak. Untuk mengelakkan kesan ini, keratan tisu biasanya direndamkan dalam etanol mengikut giliran yang berikut:
1. Rendamkan dalam etanol 30% selama 1 minit.
2. Pindahkan ke etanol 50% selama 1 minit;
3. Pindahkan ke etanol 70% selama 1 minit;
4. Pindahkan ke etanol 90% selama 2 minit;
5. Pindahkan ke etanol 95% selama 2 minit.
6. Pindahkan ke etanol 100% selama 2 minit.
7. Pindahkan ke etanol 100% yang baru selama 2 minit lagi.
Sekiranya sebelum pendehidratan keratan tisu itu telah direndam dalam sejenis pewarna yang menggunakan etanol 70% sebagai pelarutnya, maka dalam proses pendehidratan yang berikutnya keratan tisu itu TIDAK perlu direndamkan ke dalam etanol 30% , 50% dan 70% lagi ianya boleh terus dimasukkan ke dalam etanol 90%, dan selanjutnya ke dalam etanol 95%, 100%, seperti susunan tersebut di atas.
(V) Mencuci.
Jika lekapan hendak dibuat dengan menggunakan balsam kanada maka selepas pendehidratan, etanol dalam keratan tisuitu mesti dikeluarkan. Ini adalah kerana etanol tidak boleh bercampur dengan balsam kanada. Proses pembuangan etanol dari keratan tisu ini dinamakan mencuci. Akan tetapi, jika gliserol dan bukan balsam kanada yang akan digunakan dalam lekapan, proses mencuci boleh ditinggalkan kerana etanol boleh bercampur dengan gliserol.
Untuk mengeluarkan etanol, keratan tisu biasanya dirandamkan dalam cecair xilem (awas:beracun) selama beberapa ketika. Tetapi xilem mempunyai satu kelemahan sebagai agen pencuci: ia membentuk cecair keruh jika terkena air (biasanya akibat dari mencuci yang kurang sempurna). Minyak cengkih dan minyak kayu cedar juga boleh digunakan sebagai agen pencuci. Jika minyak cengkih dan minyak kayu cedar digunakan, keratan tisu itu mesti direndamkan dalam xilem pula sebelum lekapan dengan balsam kanada.
Vi) Lekapan
Selepas mencuci ,keratan tisu itu boleh diletakkan di atas kepingan kaca kemudian dititiskan dengan sedikit agen pelekap dan ditutup dengan sisip kaca nipis. Peranan agen pelekap ialah menyesar keluar semua udara dari keratan tisu serta memberikanya suatu angka rujuk biasa(refractive index) yang hampir dengan kaca ,iaitu lebih kurang 1.53.
agen pelekap yang biasa sekali digunakan dalam makmal sekolah ialah balsam kanada (yang dilarutkan dalam xilem), biasanya untuk sisip kekal. Akan tetapi, unutk sisip sementara , agen pelekap yang lebih sesuai ialah gliserol.
Sisip kekal yang siap disediakan mesti dilabelkan dengan butir-butir berikut:
i) Nama spesimen dan jenis keratan
( melintang, membujur, dan sebagainya.)
